aganocon
Dołączył: 03 Paź 2012
Posty: 40
|
 Wysłany: Sro Wrz 04, 2013 13:05 Temat postu: |
 |
|
Mikromacierze cDNA – MOŻLIWOŚCI
-Zastosowanie techniki mikromacierzy cDNA pozwala na uzyskanie z małej liczby eksperymentów bardzo dużej liczby informacji na temat swoistych genów, które ulegają stymulacji lub represji pod wpływem działania różnych związków chemicznych, potencjalnie nadających się do prac rozwojowych nad nowymi kosmetykami
-Technikę te można stosować do identyfikacji związków chemicznych, których można użyć jako leki w leczeniu różnych chorób skóry
-Przydatna do wykrywania substancji, które mogą zmniejszyć nasilenie, spowolnić proces starzenia się skóry.
-Mikromacierze pozwalają szybko analizować właściwości substancji czynnych kosmetyków, wyciągów roślinnych stosowanych w produktach do pielęgnacji skóry, w celu określenia ich korzystnego i niekorzystnego wpływu na czynność skóry.
NEUROPEPTYDY w skórze ( rola, funkcjonowanie, udział w chorobach skóry)
Reakcje pomiędzy OUN oraz układem immunologicznym
Różne typy skórnych zakończeń nerwowych uwalniających neuromediatory ( neuropeptydy) – aktywacja swoistych receptorów na komórkacvh decelowych:
-Keratynocyty,
-komórki tuczne,
- komórki Langerhansa,
-komórki śródbłonka,
-fibroblasty,
-eozynofile,
- limfocyty T,
-makrofagi,
- granulocyty wielojądrzaste.
Różnorodny efekt działania neuropeptydów:
-regulują wzrost i różnicownie się komórek
-nasilają migrację komórek zapalnych
-zwiększają ekspresję cząsteczek adhezyjnych na komórkach śródbłonka
-aktywują limfocyty T, eozynofile i komórki tuczne
-wpływają na wytwarzanie i uwalnianie różnego rodzaju cytokin
( TNF-alfa, IFNgamma)
Neuropeptydy- mogą być również syntetyzowane i uwalniane przez komórki
obecne w skórze i na drodze auto- oraz parakrynnej oddziaływać na inne
komórki oraz na zakończenia nerwowe
Nowa koncepcja- skóra organem spełniającym funkcje
*neurodokrynne
*immunomodulujące
*uczestniczy w wielokierunkowej komunikacji między cun.
Ważne definicje:
Hodowla in vitro – przetrzymywanie komórek, tkanek lub narządów przez okres dłuższy niż 2h przy życiu poza organizmem.
Inkubacja komórek – trwa przeważanie kilka lub kilkanaście godzin, zastosowanie w licznych badaniach biochemicznych metabolizmu komórek i w badaniach immunologicznych
Hodowla komórek – komórki rosnące (proliferujące) in vitro, nie zorganizowane w tkankę. Utrzymanie komórek przy życiu, zapewnienie takich warunków aby się namnażały. Nie zapewnia różnicowania się w tkankach.
Eksplant – wyosobniony fragment tkanki lub narządu użyty do zapoczątkowania hodowli
Hodowla pierwotna:
– hodowla wyprowadzona z komórek, tkanek lub narząów pobranych bezpośrednio z organizmu
- hodowla pierwotna zachowuj swą nazwę do czasu pierwszego pasażu, a następnie staje się linią komórkową
HOLOKLON – komórki powstające bezpośrednio z epidermlanycj komóek pnia (macierzystych) – duży potencjał proliferacyjny (do 140 podziałów)
MERAKLON – komórki powstajace z podziałów komórek holoklonu – subpopulacja, stanowiąca rezerwuar komórek dzielących się przejściowo
Komórki meraklonu – PARAKLON – słaby potencjał proliferacyjny (do 15 podziałów)
Proporcja między liczbą kom w tych subpopulacjach w hodowli keratynocytów – kontrola jakości hodowli – potencjał proliferacyjny.
EpiSkin – naskórek pełnej grubości (warstwa podstawna, kolczysta, ziarnista i rogowa)
Medium:- do naczynia hodowlanego – mieszanina liofilizowanych kolagenów I i III (imitacja skóry właściwej)- kolagen IV – imitacja błony podstawnej (pokrycie kolagenów I i III)
keratynocyty od osób dorosłych, zawieszone w medium hodowlanychhodowla – do otrzymania ciągłej warstwy komórek pokrywającej dno naczynia
hodowla umieszczana na granicy faz (pożywka/powietrze)
pożywkę zmienia się na pożywkę o wyższym stężeniu jonów Ca2+ - warunki hodowli indukują dalsze podziały i różnicowanie komórek
po około 7-10 dniach hodowli – na granicy faz – zorganizowana struktura, przypominająca architekturą żywy naskórek ludzki
naskórek – większość obecnych in vivo markerów różnicowanie komórek (Cytokeratyny)
profilagryna/filagryna, inwolukryna, keratyny 1 i 10
- wszystkie klasy lipidów cementu (wysoka zawartość ceramidów
- obecne elementy połączeń epidermalno - dermalnych (naskórek – skóra właściwa) kolagen typu IV, integryny, lamininy, kolagen typu VII
- wiele dobrze wykształconych hemidesmosomów
EpiDerm
hodowany podobnie jak Episkinkeratynocyty pochodzą z napletków noworodków
komórki wysiewane na pokrytą kolagenem nylonową siatkę
zawiera 8-12 warstw komórek: warstwę podstawną kolczystą ziarnistą i wszystkie markery różnicowania
warstwa rogowa – bardzo dobrze rozwinięta
Różnice między EpiSkin, EpiDerm, a naskórek fizjologiczny
skład chemiczny, szczególnie warstwy rogowej – nieco inny niż w naskórku fizjologicznym
- skład lipidów: wyższa zawartość TAGs (triacyloglicerole) i nieco wyższy poziom nienasyconych kwasów tłuszczowych
- nierównomiernie rozłożone lipidy (przenikanie i wchłanianie większe)
po około 14 dniach hodowli ekwiwalentu – warstwa rogowa znacznie grubsza niż w naskórku fizjologicznym (brak złuszczania się korneocytów w ekwiwalentach)
Rekonstruowana skóra zamiast testów na zwierzętach
Episkin (Imedex, L'Oreal) – testowanie kosmetyków
od 2009 roku w EU – całkowity zakaz testowania kosmetyków na zwierzętach
unijny program RECH od 2019 zostanie sprawdzonych ok 10 000 związków chemicznych
Integra ( LifeScience, Plainsborough, NJ)Kolagen + GAGi + błona silikonowa ( Integra LifeScience, Plainsborough, NJ)-dwuwarstwowa
-trójwarstwowa
-porowata struktura : włókna kolagenowe I glikozaminoglikany – macierz indukująca samoodtwarzanie się skóry właściwej na drodze stopniowego osadzania się w niej komórek własnych w trakcie jednoczesnej biodegradacji Integry
Substytut dwuwarstwowy:
Warstywa dolna – odpowiadająca skórze właściwej
-kolagen bydlęcy i chondrointyno- 5- siarczan- chrząstka rekina
-średnica porów substytutu skóry właściwej: 20-125um- optymalna dla migracji komórek śródbłonka i fibroblastów(autologicznych)
Warstwa górna- silikonowa błona, po 3-4 tygodniach ( koniecznych do wyhodowania komórek) zastępowana autologicznymi keratynocytami
-oparzenia- niezbędne szybkie zahamowanie utraty płynów
-problem- gromadzenie płynów pod substytutem, niewielki wzrost zakażeń, konieczność stosowania dodatkowo przeszczepów naskórka.
TransCyte ( Smith & Nephew, Inc., Largo, Florida)
-produkt bezkomórkowy, zawierający białka natywne skóry właściwej
-noworodkowe, allogenne fibroblasty, hodowane i namnażane na włóknach nylonowych
-po 4-6 tygodniach umieszczane na folii silikonowej – produkt o zwartej komórkowej „tkance”, duże stężenie wytworzonych ludzkich białek macierzy pozakomórkowej, wiele czynników wzrostu.
-fibroblasty są usuwane przez zamrożenie (po wytworzeniu pozakomórkowej macierzy i czynników wzrostu)
-leczenie oparzeń
-łatwy do przechowywania oraz natychmiastowego stosowania
-fibroblasty- proliferacja/synteza : czynniki wrzostu i czynników różnicowania komórek (TGF beta1, LGF, VEGF, IGF-1), kolagen (I,III, V) i komponenty macierzy pozakomórkowej
-produkt zamraża się , stosuje się produkt bezkomórkowy, pokryty ( podobnie jak Integra) silikonową powłokę, która chroni substytut przed utratą wody.
-warstwa silikonowa zastępowana wyhodowanymi in vitro autologicznymi keratynocytami ( autologicznym naskórkiem)
-ze względu na brak komórek TransCyte jest stosowany w leczeniu oparzeń II i III stopnia ( wzmożona aktywność proteolityczna enzymów degradujących składowe macierzy pozakomórkowej)
Dermagraft ( Advanced Tissue Sciences, LaJolla, CA)
Hodowla fibroblastów ( z napletków noworodków) na biodegradowalnych siatkach ( kwas poliglikolowy ( Dexon), kwas polimlekowy (Vicryl) + białka ECM pochodzące z allogenicznych fibroblastów
-kwas poliglikolowy ( Dexon) – biodegradowalny, wchłanialny, szwy chirurgiczne
-kwas polimlekowy ( Vicryl)- biodegradowalny, wchłanialny, stymulacja biosyntezy kolagenu
-białka ECM pochodzące z allogenicznych ludzkich fibroblastów
-warstwa silikonowa
-różni się od TarnsCytu sposobem zamrażania ( po zamrożeniu około 50% komórek żywych)
Zaleta: obecność żywych komórek, leczenie owrzodzeń stóp związanych z cukrzycą, odleżyn ( bardzo szybko dochodzi do powstania zmian martwiczych)
Zmiany martwicze- komórki niezdolne do wytwarzania prawidłowej ilości kolagenów i innych białek wchodzących w skład macierzy pozakomórkowej – wprowadzane komórki przejmują te funkcje i aktywnie uczestniczą w procesie gojenia
Konieczny dodatkowy pryesycyep komórek naskórka!!!
Apligraf (Graftskin)- pierwszy produkt inżynierii tkankowej posiadający zarówno warstwę epidermalną, jak i warstwę dermalną
Żel kolagenowy+ hodowlane allogeniczne HuK (ludzkie keratynocyty) + allogeniczne HuFi ( ludzkie fibroblasty)
Etapy konstrukcji LSE:
Wykonanie odlewu z bydlęcego kolagenu typu I zmieszanego z 10x stężonym koncentratem pożywki hodowlanej
Po żelifikacji, na warstwę kolagenu nakłada się mieszaninę fibroblastów w kolagenie warstwy łączą się po żelifikacji.
Prowadzenie sześciodniowej hodowli fibroblastów w standardowych warunkach.
Przygotowana konstrukcja jest zanurzona w medium hodowlanym.
Po tym czasie zmienia się pożywkę
Rozwijający się LSE jest inkubowany na granicy faz, a medium jest zmieniane na pożywkę umożliwiającą utrzymanie przy życiu fibroblastów, a równocześnie stymuluje warstwę epidermalną do różnicowania i stratyfikacji.
Po 7-10 dniach inkubacji na granicy faz Apligraf jest gotowym do użycia, dwuwarstwowym ekwiwalentem skóry.
TERAPIA GENOWA leczenie polegające na wprowadzeniu obcych kwasów nukleinowych (DNA lub RNA) do komórek
Transdukcja- proces wprowadzenia nowegp genu do komórki przez wirusa
Transformacja- zjawisko i proces aktywnego pobierania DNA, zwykle plazmidowego DNA, przez organizmy jednokomórkowe, najczęściej bakterie i drożdże Transfekcja- proces wprowadzania obcego DNA lub RNA do komórki
Metody wprowadzania genów:
-wirusowe
-niewirusowe ( fizyczne i chemiczne)
Za pośrednictwem receptorów (RMGT)
Za pośrednictwem liposomów ( LMGT)
Metody transfekcji:
Metody wprowadzania transgenu ( np. genu terapetutycznego ) oraz syntetycznych oligonukleotydów do komórek decelowych
-fizyczna ( mikroiniekcja, elektroporacja, metoda biobalistyczna- gen gun)
-chemiczna ( DEAE (dietyloaminoetylo)-dekstran, Ca 2+,
Transfekcja:
-stabilna- połączona z integracją DNA do genomu
-przejściowa- jeśli cząsteczka DNA nie ulegnie integracji, ekspresja wprowadzonego genu zostanie zgubiona w miarę podziałów komórkowych
Klasyfikacja terapii genowej: ze względu na typ komórek docelowych:
Komórki rozrodcze (gamety), Komórki we wczesnym stadium zarodkowych – GERMINALNA, Integrują z genomem komórek docelowych i zmiana dziedziczenia
Komórki ciała nie będące komórkami rozrodczymi ( gametami)- SOMATYCZNA, Rzadko integruje z genomem komórek docelowych, nie zmienia dziedziczenia.
Klasyfikacja ze względu na miejsce transferu genów:
-transfer in vivo- podanie nośnika z kwasem nukleinowym do ustroju pacjenta
-transfer ex vivo- wyizolowanie komórek z organizmu pacjenta, wprowadzenie do nich terapeutycznych DNA lub RNA- transfekcja I ponowne podanie pacjentowi
Klasyfikacja Za względu na mechanizm działania 2:
Dodawanie genów – gen uszkodzony pozostaje w swoim locus, a gen terapeutyczny wprowadzany jest w inne miejsce chromosomu ( zwiększona pula genów w komórce)
Zamiana genów- wymiana genu zmutowanego ( uszkodzonego) na gen prawidłowy w procesie rekombinacji komologicznej
doskonalenie genomu”- dodawanie genów, kodujących substancje, które fizjologicznie nie są produkowane przez modyfikowaną komórkę ( rybozymy, DNAzymy, siRNA, RNA i, triplex, oligonukleotydy antysensowne, białka wirusowe)
Mechanizm działania wprowadzonych kwasów nukleinowych:1.stymulacja komórki do produkcji białka kodowanego przez wprowadzony gen
2.hamowanie ekspresji genów przez wprowadzenie-dominujących alleli genów kodujących nieaktywne lub defektywne białko3. Modulacja ekspresji genów: poprzez wprowadzenie rybozymów (lub DNAzymów) chemicznie modyfikujących materiał genetyczny
3R Replacement- zastąpienie zwierząt w eksperymencie przez modele badawcze „ nie odczuwające cierpień”.
Reduction- zmniejszenie liczby zwierząt, na których trzeba przeprowadzić badania.
Refinement: doskonalenie metod w kierunku zmniejszenia cierpień zwierząt w eksperymencie.
W metody alternatywne wchodzą : metody in vitro, zmodyfikowane metody in vivo
wartości progowej
Test MTT:
Zdolność dehydrogenaz mitochondrialnych ( aktywne w żywych komórkach) do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (MTT) do formazanu będącego kolorowych produktem tej reakcji.
-produkt jest nierozpuszczalny w wodzie i wymaga rozpuszczenia w rozpuszczalnikach organicznych
-test wykonywany poprzez dodanie reagentu bezpośrednio do hodowli komórkowych, inkubacji 1-4 godzin i pomiarze absorbancji za pomocą profesjonalnego czytnika ( ściśle określona długość fali)
Opracowanie skutecznych prod kosm.
sub czynne kosmetyków( wit, lipidy, skł. Naw, metale, ekst roś.,peptydy, sub złuszcz.,czynn wzrostu,
współczesna kosmetologia:
opracowanie nowych składników aktywnych
innowacja w zakresie technologii
ocena skuteczności:
metody instrumentalne
ocena ekspertów
samoocena członków
opracowanie rzeczywiście skutecznych produktów kosmetycznych:
stosowanie ścisłego programu wykrywania sub metodami biologii komórkowej i molekularnej w celu zidentyfikowania sub czynnych mających pożądane działanie biologiczne (np. pobudzenie ekspresji genu kolagenu I,III lub VI)
zastosowanie tego samego programu badań przesiewowych w celu określenia, że zidentyfikowana sub czynna nie powoduje niepożądanych skutków ubocznych ze strony komórek skóry (np. pobudzenie ekspresji genu MMP-1)
opracowanie postaci do stosowania miejscowego która po zastosowaniu wykaże zdolność przenikania odpowiedniej ilości sub czynnej przez warstwę rogową i dalej do komórek docelowych.
Komórki macierzyste komórki pnia jednocześnie dwie zdolności: potencjalnie nieograniczonej liczby podziałów
różnicowania się do innych typów komórek
Ze względu na zdolność do różnicowania komórki macierzyste dzieli się na:totipotentne – mogą ulec zróżnicowaniu do każdego typu komórek, w tym komórek tworzących łożysko pluripotentne – mogą dać początek każdemu typowi komórek dorosłego organizmu z wyjątkiem komórek łożyska multipotentne – mogą dać początek kilku różnym typom komórek, z reguły o podobnych właściwościach i pochodzeniu embrionalnym
unipotentne, inaczej komórki prekursorowe, mogą różnicować tylko do jednego typu komórek
Ze względu na ich pochodzenie komórki macierzyste dzieli się na:embrionalne komórki macierzyste (ESC) – wyprowadzone z komórek embrionalnych. Mogą być totipotentne (gdy pochodzą z kilkukomórkowego embrionu) lub pluripotentne (gdy pochodzą z węzła zarodkowego blastocysty) somatyczne (dorosłe) komórki macierzyste – znajdowane w tkankach dorosłych organizmów; komórki te są multipotentne (jak np. komórki hematopoetyczne) lub unipotentne (np. mięśniowe komórki satelitarne)
TGFbeta -białko, składające się z 3 izoform: TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. Należy do większej rodziny białek zwanej nadrodziną transformującego czynnika wzrostu, która zawiera m.in. inhibinę, aktywinę, AMH, białka morfogenetyczne kości. TGF-β kontroluje proliferację oraz różnicowanie w większości typów komórek. Ma działanie przeciwzapalne. Uczestniczy w procesie gojenia się ran. Przez mechanizmy autokrynne i parakrynne stymuluje fibroblasty do odkładania kolegenu, hamuje koagulazę, wzmaga angiogenezę jest chemotaktyczny dla fibroblastów.
FGF- czynnik wzrostu fibroblastów wiąże heparynę, stymuluje angiogenezę i proliferację fibroblastów, które powodują powstawania ziarniny wypełniając przestrzeń rany.
CYTOKINY:są to glikoproteiny, składające się z aminokwasów i grupy cukrowej przekazywanie informacji wszystkich procesów komórkowych np. procesów wzrostu komórek i śmierci, przesyłanie i odbieranie informacji również do przestrzeni międzykomórkowej biorą udział w procesach odpornościowych
wykazują podobieństwo do hormonów ale działają miejscowo.
Funkcje cytokin to pobudzanie lub hamowanie takich czynności życiowych komórek jak:rozmnażanie wzrost migracja komórek ukł odpornościowego do miejsca zakażenia
Czynniki wzrostowe w gojeniu się rany Naczyniowy śródłbłonkowy czynnik wzrostowy : pośredniczy w angigenezie działa chemotaktycznie na komórki śródbłonka powoduje podziały komórek śródbłonka i keratynocytów
Czynnik wzrostowy hepatocytów pośredniczy w tworzeniu i odnowie tkanek
czynnik wzrostowy pochodzenia płytkowego działa chemotaktycznie na fibroblasty i makrofagi mitoza fibroblastów i Rola cytokin w gojeniu się ran:kontrolują układ nerwowy,hormonalny i cały układ cytokinstymulują i regulują procesy naprawcze podczas zranienia pojawia się w tkankach uszkodzonych wiele cytokin wykrywalnych w bardzo zróżnicowanych stężeniach
TEST ELISA- służy do określania antygenu występującego w niewielkich stężeniach. Zasadą jest wiązanie antygenu z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciw temu antygenowi a sprzężonym z enzymem. To metoda ilościowa pozwalająca określić małe stężenia badanych związków. ELISA KANAPKOWA- wykorzystuje dwa przeciwciałą monoklonalne dla tego samego antygenu z ktoórych jedno jest sprzężone z enzymem. Przeciwciało nieznakowane jest na stałe związane z powierzchnią studzienki w płytce. Przeciwaiało znakowane enzymem wiąże się z antygenem proporcjonalnie do jego ilosci.Wzrost spoistości, gęstości i jędrności skóry warunkują 3 różne mechanizmy działania peptydów, które w zależności od aktywności biologicznej można podzielić na:
peptydy sygnałowe, stymulujące aktywność fibroblastów do produkcji włókien podporowych skóry - kolagenu i elastyny, przyczyniając się do spłycania zmarszczek,
inhibitory neurotransmiterów (neuropeptydy), rozkurczają mięśnie odpowiadające za powstawanie zmarszczek mimicznych,
peptydy transportującesubstancje aktywne w głąb skóry
Peptydy są polimerami aminokwasów, w których pojedyncze jednostki aminokwasowe połączone są wiązaniem peptydowym (amidowym). Grupa aminowa jednej reszty aminokwasowej tworzy wiązanie amidowe z grupą karboksylową drugiej reszty.
oligopeptydy, zawierające od 2 do 10 reszt aminokwasowych w cząsteczce,polipeptydy, zawierające od 11 do100 reszt aminokwasowych w cząsteczce,białka, zawierające powyżej 100 reszt aminokwasowych. |
|
POMOC
Szukaj
Użytkownicy
Grupy
Rejestracja
Profil
Zaloguj się, by sprawdzić wiadomości
Zaloguj
Może coś się powtórzy na poprawie 